John Knox chào đời trong khoảng từ năm 1505 đến 1515,[1] gần hoặc ngay tại Haddington, một thị trấn của Đông Lothian.[2] Cha của Knox, William Knox, là một nông dân. Mẹ có nhũ danh là Sinclair, qua đời khi cậu còn bé.[3]

Có lẽ Knox đã theo học trường dạy tiếng Latin ở Haddington. Vào thời ấy, trở thành linh mục là lựa chọn duy nhất cho những người muốn theo đuổi sự nghiệp học thuật thay vì buôn bán hoặc làm nông.[4] Knox đến học ở Đại học St Andrews, cũng có thể là Đại học Glasgow. Knox theo học John Major, một trong những học giả vĩ đại nhất thời ấy.[5]

Năm 1540, người ta biết đến Knox như là một linh mục và là công chứng viên. Knox tiếp tục công việc này cho đến cuối năm 1543 khi ông viết trong một chứng từ công chứng đề ngày 27 tháng 3, "John Knox, chức dịch của bàn thờ thánh, Giáo phận St Andrews, công chứng viên được ủy thác bởi thẩm quyền Tông đồ."[6][7] Thay vì làm linh mục giáo xứ, ông chọn công việc dạy học cho hai con trai của Hugh Douglas ở Longniddry. Ông cũng dạy học cho con trai của John Cockburn ở Ormiston.[8][9] Cả hai địa chủ này đều ủng hộ tư tưởng cải cách, lúc ấy đang lan truyền rộng rãi khắp châu Âu.[10]